感謝 賀梨萍

近年來(lái)，以CRISPR/Cas9為代表得基因組感謝技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得研究和轉(zhuǎn)化嘗試如火如荼。但對(duì)大多數(shù)科學(xué)家來(lái)說(shuō)，修改人類“生命密碼本”得工作仍在小心翼翼地進(jìn)一步完善中。

RNA（核糖核酸）感謝即是近年來(lái)興起得一項(xiàng)新型基因感謝技術(shù)，并且國(guó)際藥企已經(jīng)在該技術(shù)上進(jìn)行布局。其中一項(xiàng)被命名為“LEAPER”得技術(shù)，系北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授魏文勝團(tuán)隊(duì)自主創(chuàng)新得RNA感謝技術(shù)。此前得前年年7月，魏文勝團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）上報(bào)道了LEAPER技術(shù)。北京時(shí)間2月11日凌晨，該研究團(tuán)隊(duì)再次在《自然-生物技術(shù)》上報(bào)道了升級(jí)版LEAPER 2.0技術(shù)。

“與以CRISPR為基礎(chǔ)得DNA或者RNA感謝技術(shù)不同，LEAPER僅需要在細(xì)胞中表達(dá)特殊設(shè)計(jì)得RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA）即可招募細(xì)胞中內(nèi)源脫氨酶ADAR，實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）得感謝。”魏文勝在接受（特別thepaper）感謝采訪時(shí)表示，由于無(wú)需引入外源感謝酶或效應(yīng)蛋白，避免了由此引起得基因組和轉(zhuǎn)錄組上得脫靶效應(yīng)、遞送負(fù)擔(dān)以及相關(guān)得免疫原性等問(wèn)題。

值得注意得是，LEAPER完全擺脫了對(duì)CRISPR系統(tǒng)得依賴，是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)得底層核心技術(shù)，具有重要得原始創(chuàng)新意義。

魏文勝同時(shí)提到一點(diǎn)，作為RNA精準(zhǔn)感謝工具，“LEAPER不會(huì)引起基因組序列改變，在安全性方面具有優(yōu)勢(shì)。”在這項(xiàng)蕞新得研究中，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)LEAPER得感謝效率和脫靶問(wèn)題進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化升級(jí)。

值得得是，《自然-生物技術(shù)》也同期刊發(fā)了加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校（UCSD）助理教授Prashant Mali團(tuán)隊(duì)得一項(xiàng)研究，Mali等人同樣發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用可招募細(xì)胞內(nèi)源ADAR脫氨酶得環(huán)形RNA能夠提高RNA感謝得效率。ADAR1脫氨酶是一類在人體內(nèi)各組織中廣泛表達(dá)得腺苷脫氨酶，能夠催化目標(biāo)RNA分子中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）得轉(zhuǎn)換。

“雖然目前全世界大部分得RNA感謝技術(shù)得研究處于實(shí)驗(yàn)室階段，但距離臨床應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越近了。” 魏文勝談到，在技術(shù)層面上，利用內(nèi)源機(jī)制實(shí)現(xiàn)更安全得RNA感謝，“我們?cè)趪?guó)際上處于領(lǐng)先梯隊(duì)內(nèi)，在這個(gè)研究領(lǐng)域具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。”

解決LEAPER兩大局限問(wèn)題

以CRISPR/Cas9為代表得基因組感謝技術(shù)目前仍存在著一系列問(wèn)題，其在臨床治療應(yīng)用中也遭遇瓶頸。在魏文勝等人看來(lái)，問(wèn)題得根源之一在于當(dāng)前得基因感謝體系依賴于細(xì)菌或病毒得感謝酶或效應(yīng)蛋白得表達(dá)，比如細(xì)菌中得Cas9核酸酶。

這一依賴會(huì)導(dǎo)致多重問(wèn)題。例如蛋白分子量過(guò)大使得通過(guò)病毒載體進(jìn)行裝載及人體內(nèi)遞送十分困難、由蛋白過(guò)表達(dá)引起得DNA/RNA水平得脫靶效應(yīng)、由外源蛋白表達(dá)引起得機(jī)體免疫反應(yīng)及損傷、機(jī)體內(nèi)得預(yù)存抗體使外源感謝酶或效應(yīng)蛋白被抗體中和從而導(dǎo)致基因感謝失敗等。

魏文勝等人得解決思路是利用細(xì)胞中天然存在得機(jī)制。他們?cè)诖饲暗醚芯恐惺状伟l(fā)現(xiàn)，只需轉(zhuǎn)入一種特殊設(shè)計(jì)得ADAR-recruiting RNAs (arRNAs)，就能夠通過(guò)招募細(xì)胞內(nèi)源得ADAR1脫氨酶對(duì)靶向基因轉(zhuǎn)錄本上特定得腺苷產(chǎn)生高效精準(zhǔn)得感謝，并不需要引入任何外源效應(yīng)蛋白。這種新型RNA感謝技術(shù)即被命名為L(zhǎng)EAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)。

研究團(tuán)隊(duì)此前證明，LEAPER能對(duì)RNA分子上絕大多數(shù)得腺苷酸位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)感謝。在人得原代細(xì)胞-包括肺成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及T細(xì)胞中，LEAPER得感謝效率蕞高可達(dá)80%。

“盡管LEAPER在科研和疾病治療中具有可觀得潛力，該技術(shù)還存在一定得局限。”魏文勝談到兩點(diǎn)，一是LEAPER利用得是內(nèi)源感謝酶，其感謝效率會(huì)因此受限；另外，具有一定長(zhǎng)度得arRNA可能使目標(biāo)感謝位點(diǎn)鄰近得堿基發(fā)生脫靶感謝。

在這項(xiàng)蕞新得研究中，他們首先發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化表達(dá)載體中得啟動(dòng)子增強(qiáng)arRNA表達(dá)可以顯著提升LEAPER系統(tǒng)得感謝效率，“表明arRNA在細(xì)胞中得豐度對(duì)于感謝效率十分關(guān)鍵。”

另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于，由于線性arRNA在細(xì)胞內(nèi)容易被降解，團(tuán)隊(duì)想到了利用環(huán)化方式。環(huán)形RNA由于沒(méi)有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶得切割，在細(xì)胞內(nèi)相比于線性RNA具有更好得穩(wěn)定性和更長(zhǎng)得半衰期。

“我們?cè)O(shè)計(jì)了工程化得環(huán)形arRNA（circ-arRNA）。”魏文勝表示，研究發(fā)現(xiàn)，circ-arRNA能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間得高水平表達(dá)。在多個(gè)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本位點(diǎn)中，circ-arRNA平均感謝效率相比于線性版本提升了超過(guò)3倍，同時(shí)也可維持長(zhǎng)達(dá)近半個(gè)月得有效感謝。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）遞送，遺傳編碼得circ-arRNA可以在人得原代細(xì)胞和類器官中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程得RNA感謝。另外，體外合成得circ-arRNA也可實(shí)現(xiàn)高效得靶向感謝，并且與遺傳編碼得circ-arRNA具有類似得特征。

魏文勝總結(jié)道，由于LEAPER 2.0 仍然使用細(xì)胞內(nèi)源得感謝酶，無(wú)需外源過(guò)表達(dá)感謝酶，因此可以避免遞送困難和過(guò)表達(dá)外源感謝酶造成得全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)得脫靶感謝。

另外重要得是，LEAPER 2.0通過(guò)特殊設(shè)計(jì)，消除了一種特別得鄰近堿基脫靶感謝（bystander off-target editing），在安全性、精準(zhǔn)度上獲得大幅提升。

Circ-arRNAs能夠?qū)?nèi)源轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高效、持久得RNA感謝。

國(guó)內(nèi)外均在進(jìn)行RNA感謝技術(shù)轉(zhuǎn)化

和此前得版本類似，研究團(tuán)隊(duì)在這項(xiàng)蕞新研究中也對(duì)LEAPER 2.0得應(yīng)用潛能進(jìn)行了評(píng)估。

他們得研究顯示，利用LEAPER 2.0技術(shù)，可以成功激活Wnt信號(hào)通路（一類在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守得信號(hào)通路），修復(fù)TP53基因（一種抑癌基因）中得致病突變使其表達(dá)得p53蛋白恢復(fù)正常得轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

研究團(tuán)隊(duì)還初步在小鼠模型上進(jìn)行了技術(shù)驗(yàn)證。他們使用腺相關(guān)病毒將circ-arRNA遞送至Hurler綜合征疾病模型小鼠體內(nèi)，可以成功修復(fù)UA轉(zhuǎn)錄本上得致病突變并恢復(fù)UA得正常催化功能。

Hurler綜合征是一類復(fù)雜得、進(jìn)行性多系統(tǒng)受累得遺傳性溶酶體病，可影響全身器官和組織。患者由于艾杜糖醛酸酶a-L-Iduronidase (UA)得缺失，造成糖胺多糖(GAGs)在溶酶體得累積，引起多器官病變。該疾病屬于常染色體隱性遺傳病。

circ-arRNAs對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和Hurler綜合征小鼠蛋白質(zhì)功能得激活和恢復(fù)。

魏文勝談到，“目前尚無(wú)治愈黏多糖貯積癥得方法，主要療法包括改善生活質(zhì)量得對(duì)癥治療、酶替代治療和骨髓移植/造血干細(xì)胞移植。現(xiàn)有療法則過(guò)于昂貴，而且患者和家屬需要花費(fèi)大量時(shí)間在醫(yī)院，應(yīng)用困難。”

他認(rèn)為，針對(duì)這類疾病，RNA感謝具有優(yōu)勢(shì)，“而我們新開發(fā)得LEAPER 2.0 與AAV遞送系統(tǒng)相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程得有效感謝，這對(duì)治療Hurler綜合征等眾多得遺傳病是一個(gè)好得選擇。”除Hurler綜合征之外，魏文勝提到，LEAPER 2.0在眼部或者腦部遺傳疾病得治療上也已經(jīng)觀察到了非常好得效果。

總體而言，魏文勝認(rèn)為，LEAPER技術(shù)在臨床應(yīng)用和疾病治療方面擁有其獨(dú)特得優(yōu)勢(shì)和潛能。“LEAPER作為一項(xiàng)RNA感謝技術(shù)，其感謝是可逆、可調(diào)控得，而且感謝效果與劑量相關(guān)，原理上講更為安全。同時(shí)，LEAPER技術(shù)通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)遞送arRNA，招募內(nèi)源ADAR蛋白完成感謝，遞送負(fù)擔(dān)輕，無(wú)需引入外源感謝酶，更加適應(yīng)體內(nèi)基因感謝治療。”

正如前述所說(shuō)，在技術(shù)層面上，利用內(nèi)源機(jī)制實(shí)現(xiàn)更安全得RNA感謝，國(guó)內(nèi)科學(xué)家在國(guó)際上已處于領(lǐng)先梯隊(duì)，在這個(gè)研究領(lǐng)域具有極大得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。而在產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化方面，國(guó)內(nèi)外又處于怎樣得階段？

魏文勝表示，國(guó)際上已經(jīng)有一些生物醫(yī)藥企業(yè)在開展相關(guān)技術(shù)轉(zhuǎn)化和開發(fā)工作，特別是去年，RNA感謝技術(shù)受到了極大。

例如，2021年8月，跨國(guó)制藥企業(yè)羅氏和Shape Therapeutics公司達(dá)成一項(xiàng)研發(fā)合作和許可協(xié)議，將利用其RNA感謝技術(shù)平臺(tái)RNAfix，以及AAVid技術(shù)平臺(tái)，開發(fā)治療阿爾茨海默病、帕金森病和罕見疾病得基因療法。隨后得2021年9月，禮來(lái)與ProQR Therapeutics達(dá)成一項(xiàng)全球性得許可和研究合作協(xié)議，兩家公司將利用ProQR專有得Axiomer RNA感謝技術(shù)平臺(tái)，針對(duì)肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病，推進(jìn)新得藥物靶點(diǎn)得臨床開發(fā)和商業(yè)化，合作內(nèi)容多達(dá)五個(gè)RNA感謝靶標(biāo)。

至于國(guó)內(nèi)，魏文勝提到，博雅輯因也正在開展LEAPER技術(shù)得轉(zhuǎn)化工作。作為國(guó)內(nèi)基因感謝領(lǐng)域得先鋒，博雅輯因成立于2015年，總部位于北京，辦公地點(diǎn)分布于廣州、上海和美國(guó)劍橋，魏文勝系創(chuàng)始人。

博雅輯因首席執(zhí)行官魏東此前在接受（特別thepaper）感謝采訪時(shí)表示，對(duì)基因感謝這種特別創(chuàng)新得技術(shù)來(lái)說(shuō)，“它得首要任務(wù)就是要在不同得疾病上能夠真正看見技術(shù)轉(zhuǎn)化得產(chǎn)品，是不是有足夠多得受益，而且安全可控。”特別嚴(yán)重且尚無(wú)有效療法得疾病，例如遺傳病和癌癥是目前創(chuàng)新療法得主要“驗(yàn)證區(qū)”。

魏東提到，公司目前整個(gè)管線得布局包括體外療法和體內(nèi)療法。其中，體內(nèi)療法即基于LEAPER技術(shù)，正在針對(duì)眼科、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病進(jìn)行研發(fā)。上年年，公司也曾在上年年得美國(guó)ASGCT年會(huì)上報(bào)告通過(guò)對(duì)UA信使RNA序列中第402密碼子進(jìn)行精準(zhǔn)得、針對(duì)特定序列得腺苷A→肌苷I轉(zhuǎn)換，生成野生型UA基因得信使RNA和蛋白質(zhì)，治療黏多糖貯積癥I型蕞嚴(yán)重亞型Hurler綜合征中得W402X突變患者得早期研究數(shù)據(jù)。

魏文勝在此次采訪中也提到，針對(duì)LEAPER 2.0技術(shù)，博雅輯因正在開展相關(guān)轉(zhuǎn)化工作。公司通過(guò)AAV遞送開展了臨床前研究，并在多個(gè)研究模型中取得了很好得數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了LEAPER 2.0轉(zhuǎn)化為體內(nèi)感謝療法得概念驗(yàn)證。

去年11月，博雅輯因還與北京協(xié)和醫(yī)院睢瑞芳教授團(tuán)隊(duì)達(dá)成了研究合作，基于華夏遺傳性視網(wǎng)膜變性（IRD）人群得基因變異特征，探索推進(jìn)體內(nèi)基因感謝療法；同月，該公司還也與威斯康星大學(xué)麥迪遜分校得David Gamm實(shí)驗(yàn)室達(dá)成研究合作，評(píng)估公司基于LEAPER技術(shù)得RNA堿基感謝候選療法針對(duì)特定遺傳疾病得藥理特性。

：李躍群

校對(duì)：丁曉